宣布日期：2021-12-03 宣布人：asiagame生物
近年来，随着噬菌体在临床上治疗细菌熏染、在食物中举行生物控制的普遍应用，使得对在重大样品中举行噬菌体计数和检测的要领的需求越来越大。
由于抗生素滥用及太过使用，导致细菌耐药形势日益严肃。噬菌体作为熏染细菌的病毒，能够特异性的杀灭耐药细菌，使得噬菌体治疗重新进入人们的视野。一方面，为了有用评估噬菌体临床治疗的效果、展现微生物群落的重大动态，需要准确的要领来计数和检测噬菌体颗粒 ；另一方面，噬菌体计数也是生产和开发以噬菌体为基础的产品、检测细菌熏染和食物生物防治所必需的。凭证检测工具的差别（熏染性噬菌体、全噬菌体颗粒、核酸和卵白质），本周为各人简朴先容一些目今主要使用的噬菌体计数和检测要领。
01 熏染性噬菌体检测要领
噬菌斑计数被以为是噬菌体计数的金标准。双琼脂笼罩试验（DLA）允许在含有两层琼脂的受限情形（作育皿）中举行局部噬菌体与宿主细菌的接触。其中，底层为含有1%-1.5%琼脂的作育基以支持细菌生长，顶层含有相同的作育基，但琼脂浓度较低（0.4%至0.6%），通常被称为软琼脂。将顶层与宿主细菌混淆后倒在底层上，形成所谓的草坪，再将含有噬菌体的样品添加在顶层，干燥 ；或者噬菌体和宿主细菌孵育后与顶层混淆，倒在底层上，然后在细菌生长的最佳温度和时间下作育。若是噬菌体能够熏染被测细菌，则草坪上会泛起清晰的黑点或斑块。单个菌斑是最月朔个噬菌体裂解一个宿主细菌，然后子女噬菌体杀死相近细菌的效果。噬菌体原种或样本中熏染性噬菌体的浓度（即滴度）可以通过在草坪上点样稀释的样原来确定，滴度用菌斑形成单位（PFU，类似于菌落形成单位）体现（见图1）。
02 全噬菌体颗粒检测要领
透射电子显微镜（TEM）使用电子束爆发的区分率比古板光学显微镜高1000倍，提高区分率（降到0.2 nm）足以视察到病毒。只管样本高度浓缩（10^6个颗粒/毫升）才华爆发可靠的效果，但这项手艺可以用来量化病毒颗粒。用透射电子显微镜举行病毒定量在确定病毒形态类型和总数方面具有很高的准确性，可是当运行多个样品时，该手艺耗时、腾贵，并且不可用于重大的样本。别的，样品的制备也很繁琐，并且需要熟练的操作职员来操作重大的仪器。
另一种计数整个噬菌体颗粒的手艺是流式细胞术。在本项手艺中，病毒颗粒被荧光染料标记并被指导通过毛细管。毛细管的直径小，迫使颗粒以单线流动，从而可以检测由每个病毒颗粒引起的光散射。该要领快速且严谨，因此获得了普遍应用。值得注重的是，荧光信号与基因组巨细无关，但混淆样本中的差别病毒可以凭证他们的荧光和侧向散射漫衍区来区分。
由NanoSight Limited公司开发的一种基于激光的要领可以实时可视化，基于激光照明光学显微镜的动态光散射在几分钟内便可以计数病毒颗粒。但该手艺需要相对较高的样品浓度（10^7-10^9 PFU / ml）和清亮的液体，关于土壤和粪便等重大的样本很难获得切合标准的样品。
03 噬菌体核酸和卵白质检测要领
聚合酶链式反应（PCR）是一种简朴而可靠的要领，它以核酸检测为基础，能比噬菌斑测定更快地验证噬菌体的保存。通过应用随机扩增多态性DNA (RAPD) PCR还可以在几小时内区分出差别的噬菌体谱系，而不需要举行全基因组测序。然而，由于噬菌体中没有普遍保存的标记性基因（如细菌中的16S rRNA基因），因此设计针对整个噬菌体多样性的引物很贫困。PCR的另一个弱点是效果不可量化，由于该反应具有终点特征。随着该领域的前进，开发了定量PCR（qPCR）。类似地，卵白质检测领域也迅速生长，液相色谱-串联质谱法（LC-MS-MS）可用于准确检测和计数未知样品中的多肽。
嵌入荧光染料的发明使人们能够丈量每个PCR循环后聚合的DNA产品的量，即定量聚合酶链式反应（qPCR）要领。荧光由热循环仪纪录，能够一步扩增核酸并检测荧光。盘算初始DNA浓度时，可以将标准用作参考。整个qPCR平台中使用了两种基本化学因素：第一种是嵌入荧光DNA染料，第二种是通过探针、附加的带有荧光染料和猝灭剂分子的短DNA片断举行操作。关于双链DNA的定量，嵌入染料的使用选择性较量低，使用荧光标记的探针更准确，由于只有在所有三个DNA片断（正向引物，反向引物和探针）乐成杂交并随后聚合后才华爆发信号，这两种要领已普遍用于噬菌体生物学。
在液滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）中，将样品与疏水性物质混淆形成水油乳状液，反应在每个液滴中同时举行。将混淆物通过荧光检测器来计数在总液滴数目上爆发放大的液滴数目。这与样品稚瘢板DNA的数目成比例，因此无需外部标准就可以用于盘算初始浓度。
全基因组测序（WGS）不需要预先疏散，即可通过生物信息学剖析对完整的噬菌体基因组举行测序和组装。Illumina测序手艺通常用于识别新的噬菌体，还可以检测来自差别栖息地的病毒，可是它们并没有针对计数举行优化。一些关于品貌的信息可能会被从组装的重叠群的数目中提取出来，从而提供半定量数据。可是在重叠群组装历程中数据的丧失，可能会导致样本中噬菌体的数目被低估。别的，细菌宿主DNA的携带、缺乏参考噬菌体基因组的数据库以及噬菌体基因组的镶嵌性子使抱病毒全基因组测序作为一种计数和检测要领具有一定的挑战性，除非事先知道序列。
04 重大样品中噬菌体的定量
对重大样本（例如临床样本、粪便或食物）中的噬菌体举行计数和检测，由于可能影响效果的化学化合物的保存，需要举行特殊处置惩罚。若是要从重大样品中定量单个噬菌体，必需先相识噬菌体及其宿主，以便对它们的动力学有一个完整的相识。相反，若是asiagame目的是量化整个噬菌体种群，那么asiagame挑战就是去除抑制物。通常，起始的离心办法会去除较大的颗粒，然后使用聚四氟乙烯膜过滤器（孔径为0.22 mm-0.45 mm）过滤，滤液中会富含病毒颗粒。使用聚乙二醇浓缩滤液以获得高浓度的病毒悬浮液，以举行计数和检测，如使用DLA。别的，基于PCR的要领，在病毒核酸疏散之前应举行物理疏散，以最洪流平地镌汰PCR抑制剂的残留。使用全基因组测序对重大样品中的噬菌体举行计数时，一个主要办法是对读数举行过滤，以去除可能滋扰后续剖析的非病毒序列。总之，在处置惩罚重大样品时，选择合适的预处置惩罚要领、下游要领对获得关于噬菌体浓度的综合效果很主要。
近年来，随着噬菌体在临床上治疗细菌熏染、在食物中举行生物控制的普遍应用，使得对在重大样品中举行噬菌体计数和检测的要领的需求越来越大。最普遍使用的选择是DLA要领，由于它在测定熏染性噬菌体计数方面具有快速、廉价和准确的优点。同时，几种分子生物学手艺提高了速率和可重复性，可是这些要领不可区分熏染和缺陷的病毒颗粒，因此得出的效果很难与古板的DLA空斑剖析举行较量。分子和噬菌体生物学的刷新可以将目今使用的计数和检测要领的优点团结起来，而这将有助于开发新的计数和检测要领。
